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Home Virologie générale Concepts généraux

Concepts généraux

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Comprendre les virus pour mieux les combattre


Concepts généraux: Diversité des virus

Les virus sont des entités minuscules et non vivantes qui se copient une fois à l'intérieur des cellules hôtes vivantes. Tous les organismes vivants (animaux, plantes, champignons et bactéries) ont des virus qui les infectent. Typiquement, les virus sont constitués d'une couche (ou capside) qui protège sa molécule d'information (ARN ou ADN); Ces molécules d'information contiennent les empreintes bleues pour faire plus de virus. Les virus sont très divers en ce qui concerne leur forme, leur taille, leur information génétique et leur pouvoir infectieux. Les virus sont tout autour de nous, en moyenne un corps humain rencontre des milliards de particules virales chaque jour. Nos voies intestinale, respiratoire et urogénitale sont des réservoirs pour de nombreux types de virus, il est étonnant qu'avec une telle exposition constante, il y ait peu ou pas d'impact de ces organismes dans la santé humaine. Le mécanisme de défense de l'hôte est assez fort pour éliminer tout cela dans un état normal, alors qu'ils causent de nombreuses maladies méchantes seulement lorsque la personne est immunodéprimée. Bien que les virus aient une gamme limitée d'hôtes, mais parfois ils peuvent sauter la barrière des espèces et provoque des maladies mortelles, la propagation récente de la grippe porcine est un exemple idéal de ce type de propagation.

Les virus épidémiques, tels que la grippe et le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), causent des maladies qui se propagent rapidement à une grande population humaine en un rien de temps et semblent attirer plus d'attention scientifique et publique que les virus endémiques qui sont continuellement présents dans un Population particulière.

La virologie comme une discipline est simplement âgée de 100 ans et la façon dont elle s'est développée dans cette petite période de temps est galopante. Le regroupement des nouveaux virus émergents dans un groupe spécifique en spécifiant certains paramètres a été initié en 1966 lors de la création du comité international sur la taxonomie des virus (ICTV) dans le but de classer les virus. L'ICTV a adopté une norme pour la description des virus. Le nom des genres, des sous-familles, des familles et des ordres doit être un seul mot, se terminant par les suffixes -virus, -virinae, -viridae et -virales respectivement. Dans l'utilisation écrite, le nom doit être en majuscule et en italique.

Les virus sont des parasites obligés, ce qui signifie leur dépendance absolue au système hôte vivant. Cette propriété du virus en a fait un outil précieux pour étudier les fonctions cellulaires et sa biologie. L'adénovirus est un exemple de virus ADN qui entre dans le noyau hôte mais qui reste séparé du génome hôte et qui, en même temps, utilise une machine de cellule hôte pour sa replication. D'autre part, la grippe est un virus à ARN qui porte sa propre enzyme pour reproduire son génome alors que les protéines virales sont synthétisées en utilisant la machine de la cellule hôte. Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est un rétrovirus; Il contient de l'ARN en tant que matériel génétique, mais il se transforme en ADN après son entrée dans la cellule hôte par une enzyme appelée transcriptase inverse. Il contient également des enzymes dans son virion, à savoir l'intégrase et la protéase virale qui aident le VIH pendant le processus de maturation à l'intérieur des cellules infectées. La surface externe du virion du VIH contient deux glycoprotéines de surface appelées gp120 et gp41 qui aident à l'attachement du virus à la surface cellulaire.

Figure 2.1. Diagramme schématique du VIH

Concepts généraux: Formes de virus

Une étude précoce avec le virus de la mosaïque du tabac (TMV) a fortement suggéré que les virus étaient composés de sous-unités répétées de protéines qui ont été ultérieurement supportées par la cristallisation du TMV. Un progrès majeur dans la détermination de la morphologie du virus a été le développement de la microscopie électronique de taches négatives. Une autre modification de la microscopie électronique classique est la microscopie cryo-électronique où les échantillons contenant le virus ont été rapidement congelés et examinés à une température très basse; Cela nous permet de préserver la structure native des virus.

Un virion est une particule virale complète qui est entourée par la protéine de la capside et encapside le génome viral (ADN ou ARN). Une fois la structure sans acide nucléique peut être visible sous le microscope électronique, ces structures sont appelées capsides vides. Dans certains virus comme les paramyxovirus, l'acide nucléique est entouré par les protéines de la capside et les structures composites sont appelées nucléocapside. Certains des virus contiennent l'enveloppe lipidique qui entoure les nucléocapsides. Les enveloppes sont dérivées de la membrane de la cellule hôte pendant le processus de bourgeonnement. Comme les enveloppes sont dérivées de la membrane de la cellule hôte, elles contiennent une grande partie des protéines de surface présentes dans les cellules hôtes.

Il existe deux types de symétrie parmi les virus: icosaédriques et hélicoïdaux. En théorie, la symétrie icosaédrique peut parfois être appelée sphérique sur la base de la morphologie externe. La symétrie Icosaédrique comporte 12 sommets, 30 arêtes et 20 faces. Ils ont également une symétrie de deux, trois ou cinq fois, basée sur la rotation à travers des axes passant par leurs bords, faces et sommets respectivement (figure 3.1). Les virus de ce type ont une forme sphérique. En symétrie hélicoïdale, l'ARN génomique forme une spirale à l'intérieur du noyau des nucléocapsides (figure 3.2). Les virus de ce genre ressemblent à des rondelles ou filamenteux. Les virus qui contiennent de gros génomes d'ADN sont plus complexes en structure, par exemple les poxvirus et les herpèsvirus.

Figure 3.1. Une structure de virion icosaédrique montrant deux, trois et cinq symétries

Figure 3.2. Structure du virus à symétrie hélicoïdale.

Table 3.1. Shape of viruses belonging to different families

Famille

Forme

Poxviridae

Pleomorphe

Iridoviridae

Icosahedral

Asfarviridae

Spherical

Herpesviridae

Icosahedral

Adénoviridae

Icosahedral

Polyomaviridae

Icosahedral

Papillomaviridae

Icosahedral

Hepadnaviridae

Sphérique

Circoviridae

Icosahedral

Parvoviridae

Icosahedral

Retroviridae

Spherical

Reoviridae

Icosahedral

Birnaviridae

Icosahedral

Paramyxoviridae

Pleomorphe

Rhabdoviridae

Bullet en forme

Filoviridae

Filamenteux

Bornaviridae

Sphérique

Orthomyxoviridae

Pleomorphe

Bunyaviridae

Sphérique

Arenaviridae

Sphérique

Coronaviridae

Sphérique

Arteriviridae

Sphérique

Picornaviridae

Icosahedral

Caliciviridae

Icosahedral

Astroviridae

Icosahedral

Togaviridae

Sphérique

Flaviviridae

Sphérique

Concepts généraux: Taille du virus

Les virus sont généralement beaucoup plus petits que les bactéries et leur taille moyenne varie de 25 à 300 nm de diamètre. Ils sont visibles au microscope électronique et seuls les virus les plus grands et les plus complexes sont observés sous microscope optique à haute résolution. Les virus les plus petits appartiennent aux familles Circoviridae, Parvoviridae et Picornaviridae qui mesurent environ 20-30 nm de diamètre alors que le plus grand appartient à Poxviridae qui mesure environ 250-300 nm de diamètre. Récemment, les scientifiques ont isolé une nouvelle forme de virus qui infecte l'amibe et le regroupent sous une famille distincte Mimiviridae. Les membres de la famille Mimiviridae vont de 400 à 800 nm de diamètre.

En moyenne, une cellule bactérienne est d'environ 1400 nm de diamètre tandis qu'une cellule épithéliale moyenne est d'environ 20 000 nm. Considérant que les virus et les bactéries sont presque sphériques, une cellule bactérienne a un volume environ 30 000 fois plus grand qu'un virus alors qu'une cellule épithéliale est environ 60 millions de fois plus grande.

Tableau 4.1. Taille des virus appartenant à différentes familles

Family

Size (nm)

Poxviridae

300

Iridoviridae

135-300

Asfarviridae

170-220

Herpesviridae

150

Adenoviridae

80-100

Polyomaviridae

40-50

Papillomaviridae

55

Hepadnaviridae

50

Circoviridae

12-27

Parvoviridae

15-25

Retroviridae

80-100

Reoviridae

60-80

Birnaviridae

60

Paramyxoviridae

150-250

Rhabdoviridae

100

Filoviridae

80

Bornaviridae

80-100

Orthomyxoviridae

80-120

Bunyaviridae

80-120

Arenaviridae

50-280

Coronaviridae

120-150

Arteriviridae

60-70

Picornaviridae

30

Caliciviridae

30-40

Astroviridae

30

Togaviridae

70

Flaviviridae

40-60

Concepts généraux: Composantes des génomes

En général, les virus sont constitués d'acides nucléiques (génome), de protéines (capside) et de lipides (enveloppe). Les génomes viraux peuvent être l'ADN ou l'ARN, lorsqu'une fois dans une cellule hôte, elle dirige la synthèse de nouvelles protéines virales et la réplication de nouveaux génomes viraux. Capsid est une couverture protéique qui entoure et protège le génome viral. Il est composé de nombreuses petites sous-unités appelées capsomères qui déterminent la forme du virus. L'arrangement et la composition des capsomères varie selon les familles de virus. Les enveloppes sont des membranes bicouches lipidiques dérivées de la membrane de la cellule hôte lorsque le virus sort de la membrane plasmique ou passe par un organelle lié à la membrane (comme le corps de Golgi ou le réticulum endoplasmique). L'enveloppe contient parfois de la glycoprotéine (protéine avec des hydrates de carbone) sous la forme de pointes qui les aide dans la fixation pendant le temps d'infection à la surface de la cellule hôte (gp120 dans le VIH). Dans les virus non enveloppés, les rainures présentes dans la capside et les protéines de capside spécifiques peuvent se lier au récepteur de surface cellulaire.

La caractéristique la plus importante et la plus caractéristique d'un organisme vivant est la reproduction de son information génétique. Le mécanisme de réplication du génome se fait avec plus d'économie et de simplicité parmi les différents virus. Différentes familles de virus ont leur génome constitué d'ADN double brin (ds) ou d'ADN ou d'ARN monocaténaire (ss). Les virus qui contiennent le génome de l'ARN peuvent avoir une polarité positive, négative ou mélangée (ambisense). En outre, ils ont soit des segments simples ou multiples dans leur génome avec une topologie linéaire ou circulaire. Chacun des paramètres ci-dessus ont leurs conséquences sur les voies de replication du génome viral, l'expression du gène viral et l'assemblage du virion.

Parmi les familles de virus qui infectent les animaux et les humains, celles qui contiennent le génome de l'ARN sont plus nombreuses que celles qui contiennent le génome de l'ADN. Cette disparité est encore plus grande dans le cas des virus végétaux (on ne connaît pas de virus ADN bicaténaire infectant la plante).

5.1. Les virus encodent les enzymes et suivent des voies uniques:

Presque tous les virus encodent des protéines et des enzymes uniques, de plus ils suivent des voies uniques pour transférer leur information génétique. Ce phénomène est plus prononcé dans le cas des virus ARN, soit ils utilisent une ARN polymerase ARN dépendante, soit en cas d'ADN polymerase dépendante de l'ARN du rétrovirus (VIH) pour achever leur cycle de replication. Ces deux procédés nécessitent des enzymes uniques qui sont codées par le virus suite à une infection aux cellules hôtes et sont généralement absentes ailleurs.

L'ARN polymérase ARN dépendante et la transcriptase inverse ont une capacité de relecture minimale, de sorte que leur taux d'erreur est très élevé (1 sur 10 000) par rapport à la replication de l'ADN. Cela signifie qu'une particule de virus ARN contiendra une ou plusieurs mutations à partir de son virus parental de type sauvage. La présence de nombreuses sous-espèces différentes de particules virales dans une population est également appelée quasi-espèce de virus ARN. L'activité propice aux erreurs de la polymerase du virus de l'ARN limite la limite supérieure de taille du génome au-dessus de laquelle ils ne peuvent survivre. En conséquence de ce phénomène la plupart du virus d'ARN ont leur taille de génome dans la gamme de 5-15kb (coronavirus 30kb). Le contraire est vrai dans le cas de virus d'ADN où la correction d'épreuves et l'activité de réparation d'erreur assure la réplication précise de l'ADN viral aussi grand que 800 kb. Le fait que l'ADN est plus stable chimiquement que l'ARN nous explique probablement pourquoi tous les hôtes thermophiles contiennent des virus qui ont ADNs comme leur matériel génétique.

Tableau 5.1. Nature du génome des virus appartenant à différentes familles

Famille

Nature du génome

Poxviridae

dsDNA

Iridoviridae

dsDNA

Asfarviridae

dsDNA

Herpesviridae

dsDNA

Adenoviridae

dsDNA

Polyomaviridae

dsDNA

Papillomaviridae

dsDNA

Hepadnaviridae

dsDNA-RT

Circoviridae

ssDNA

Parvoviridae

ssDNA

Retroviridae

ssRNA-RT

Reoviridae

dsRNA

Birnaviridae

dsRNA

Paramyxoviridae

NssRNA

Rhabdoviridae

NssRNA

Filoviridae

NssRNA

Bornaviridae

NssRNA

Orthomyxoviridae

NssRNA

Bunyaviridae

NssRNA

Arenaviridae

NssRNA

Coronaviridae

ssRNA

Arteriviridae

ssRNA

Picornaviridae

ssRNA

Caliciviridae

ssRNA

Astroviridae

ssRNA

Togaviridae

ssRNA

Flaviviridae

ssRNA

DsDNA = ADN bicaténaire

SsDNA = ADN monocaténaire

ARNdb = ARN bicaténaire

SsRNA = ARN monocaténaire

NssRNA = ARN monocaténaire à polarité négative

Figure 5.1. Diversité des virus appartenant à différents groupes

 

6.1. Isolation du virus

Les virus sont des parasites intracellulaires obligatoires qui nécessitent des cellules vivantes pour se reproduire. Généralement, la culture cellulaire, les oeufs embryonnés et les petits animaux de laboratoire sont utilisés pour l'isolement des virus. Les œufs embryonnés sont très utiles pour l'isolement de la grippe et des paramyxovirus. Bien que les animaux de laboratoire soient utiles pour isoler différents types de virus, la culture cellulaire est encore un moyen préféré pour l'isolement du virus dans de nombreux laboratoires.

Pour les cultures de cellules primaires, les fragments de tissu sont d'abord dissociés en petits morceaux à l'aide de ciseaux et l'addition de trypsine. La suspension de cellules est ensuite lavée quelques fois avec un minimum de milieu essentiel et ensemencée dans une bouteille de récipient en verre ou en plastique à fond plat après la remise en suspension avec un milieu liquide approprié et un sérum de veau f? Tal. Les cellules sont maintenues dans un incubateur à 37 ° C pendant 24 à 48 heures selon le type de cellule. Cela permet aux cellules d'attacher la surface du récipient et sa division en suivant le cycle cellulaire normal.

Les cultures cellulaires sont généralement de 3 types: -

1. Culture primaire - Ces préparations sont préparées directement à partir de tissus animaux ou humains et peuvent être subcultivées une ou deux fois seulement. Fibroblaste d'embryon de poulet.

2. Culture cellulaire diploïde - Ils sont dérivés de tissus néonatals et peuvent être sous-cultivés 5-10 fois. par exemple. Cellules de fibroblastes diploïdes humains.

3. Cellules continues - Elles sont dérivées de tissus tumoraux et peuvent être sous-cultivées plus de 10 fois. par exemple. Vero, Hep2, Hela.

Les spécimens contenant du virus doivent être transportés au laboratoire le plus tôt possible après leur prélèvement. Les tampons buccaux ou cloacaux doivent être prélevés dans des flacons contenant du milieu de transport du virus. Les fluides corporels et les tissus doivent être recueillis dans un récipient stérile et scellés correctement. Si possible, tous les échantillons doivent être maintenus et transportés à froid pour des taux de récupération plus élevés.

Dès réception, les échantillons doivent être inoculés dans une culture cellulaire en fonction de l'histoire et des symptômes de la maladie. Le flacon de culture cellulaire infecté doit être observé tous les jours pour toute présence d'effet cytopathique (CPE). Certains types d'échantillons, tels que les fèces et l'urine, sont toxiques pour les cultures cellulaires et peuvent produire un effet de type CPE. Lorsque le CPE spécifique du virus est évident, il est conseillé de faire passer le fluide de culture infecté dans une culture cellulaire fraîche. Pour les virus associés aux cellules, tels que les cytomégalovirus, il est nécessaire de trypsine et de passage des cellules infectées intactes. Des virus tels que l'adénovirus peuvent être sous-cultivés après un certain temps de congélation et de décongélation des cellules infectées.

Susceptible cell lines:

Influenza virus- MDCK cells, Vero cells.

Paramyxoviruses- DF-1 cells, Vero cells.

Adenoviruses- HEK cells, HuH7 cells.

Herpesviruses- LMH cells.

Respiratory syncytia virus- Hep2 cells, Vero cells.

Figure 6.1. Virus induced CPE in cell culture

6.2. Purification du virus et des composants:

6.2.1. Ultracentrifugation:


Les virus sont habituellement purifiés à l'aide d'ultracentrifugation. La machine est capable de faire tourner les échantillons à 20 000-100 000 tr / min sous le gradient de densité de CsCl2 ou de saccharose. La densité à laquelle les virus ne coulent ni ne flottent lorsqu'ils sont suspendus dans un gradient de densité est appelée densité flottante. La vitesse à laquelle les particules virales sédimentent sous une force gravitationnelle définie est appelée coefficient de sédimentation. L'unité de base est le Svedberg (S) qui est 10 -13 sec. La valeur S d'un virus est utilisée pour estimer sa masse moléculaire.


Types de milieu de sédimentation:

A. Coussins de saccharose ou gradient - On utilise une concentration fixe ou un gradient linéaire de saccharose. L'augmentation de la densité et de la viscosité du milieu diminue la vitesse à laquelle le virus les sédimente. En général, un «coussin» de saccharose est préparé au bas du tube de centrifugation et l'échantillon contenant le virus est superposé sur le coussin. Puisque la plupart des virus ont des densités plus grandes que le saccharose, la séparation est basée sur les valeurs de S. Cette méthode peut être utilisée pour séparer des molécules avec des valeurs S relativement proches. Parfois, le glycérol est également utilisé à la place du saccharose.

B. Centrifugation en gradient de CsCl2 - On prépare un gradient linéaire de CsCl2 dans du tampon dans le tube d'ultracentrifugation. Lorsque la concentration du CsCl2 est augmentée, la densité du milieu augmente dans le tube de sorte que la densité est faible en haut et en haut en bas. Les particules virales centrifugées à travers ce milieu formeront une bande à une position égale à leur densité flottante. Ceux-ci sont utiles pour séparer des virus de différentes densités. La limitation de cette méthode est que CsCl 2 peut inactiver de façon permanente certains virus.

6.2.2. Autres techniques de séparation:

Les virus peuvent également être séparés par électrophorèse et par Chromatographie sur colonne, mais ceux-ci ne sont pas la manière préférée de séparer le virus alors que, parfois, ils sont utilisés pour séparer des acides nucléiques ou des protéines virales. Les deux méthodes séparent le virus sur la base de la charge et / ou de la taille. Le virus contient une variété de macromolécules chargées sur sa surface qui contribue à sa mobilité électrophorétique ou ses caractéristiques d'échange d'ions. Les virus sont parfois ligaturés avec le groupe chargé à séparer par Chromatographie d'échange d'ions. La chromatographie par tamis moléculaire peut également être utilisée pour purifier les virus où de grands pores sont formés à l'aide d'agarose spécial à travers lequel des particules de virus peuvent pénétrer.

6.3. Pureté des virus:

De nombreuses méthodes sont utilisées pour évaluer la pureté du virus. Le rapport d'absorption UV à 260 et 280 nm au cours d'une analyse spectrophotométrique (260/280) est une caractéristique pour mesurer la pureté d'un échantillon de virus et dépend de la quantité d'acide nucléique et de protéine présente dans le virion. Des méthodes sérologiques telles que le dosage immuno-enzymatique (ELISA), le dosage de la précipitation radioimmunologique (RIPA), le Western blot, le test de neutralisation du virus (VNT) et la fixation du complément sont également utilisés pour vérifier la puérité d'un échantillon de virus. Ces procédés nécessitent des anticorps spécifiques de protéines virales qui peuvent être monoclonaux (un type d'anticorps spécifique d'une seule protéine virale) ou polyclonaux (plusieurs anticorps différents pouvant reconnaître plusieurs protéines virales ou epitopes). Le test de plaques est également effectué afin d'isoler la colonie unique d'un pool de virus de quasi-espèces.

Figure 6.2. Une approche générale pour purifier un virus à partir de cellules de culture tissulaire

 

Last Updated on Sunday, 26 March 2017 17:20  

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